Апротинин CAS 9087-70-1

Апротинин78R2S7, молекулна формула C284H432N84O, CAS 9087-70-1, Това е протеазен инхибитор, който може да инхибира трипсина и химотрипсина, да предотврати активирането на други активни протеазоми в панкреаса и самоактивирането на трипсиногена. Клинично се използва за профилактика и лечение на остър панкреатит, кървене, причинено от фибринолиза, и дисеминирана интраваскуларна коагулация. Може да се използва и за антишоково лечение. Протеазните инхибитори са вещества, които могат да се свързват с ензими и да намалят скоростта на разграждане на субстрата. Протеазни инхибитори с протеинови свойства са широко разпространени и два вида протеазни инхибитори с протеинови свойства са изолирани от соеви зърна: Kuniz трипсин инхибитор и Baumann Bellck инхибитор. Първият има молекулно тегло 20-25 ku, докато вторият има молекулно тегло 8 ku.

Рекомбинантенапротинин(RTI16) може да инхибира кининазата и трипсина и е естествен не-специфичен инхибитор на серин протеаза. Това е едноверижен основен протеин, съставен от 58 аминокиселинни остатъка, с 3 дисулфидни връзки, кръстосано-свързани във веригата. Дълго време апротин се използва за лечение на остър панкреатит. След 90-те години рекомбинантният апротин започва да се използва в кардиоторакалната хирургия за защита на тромбоцитите, намаляване на кървенето и ексудацията и за клинично лечение на пациенти с коагулационни нарушения. Поради това размерът на пазара на апротин бързо се разшири и се превърна в едно от важните биохимични лекарства.

Синтез

 

Понастоящем наличните в търговската мрежа рекомбинантни апротинови препарати са главно екстракти от органи като белите дробове на говеда, които имат сложни процеси и висока цена. Поради това е от голямо значение да се изследва производството на рекомбинантен апротин с помощта на методи на генно инженерство.

Когато се използва система за експресия на секреция, производството на апротин обикновено е ниско и активността на получения продукт също е ниска. Чрез фузионна експресия се очаква значително да повиши нивото на експресия на рекомбинантния апротин.

 

За тази цел е конструиран рекомбинантен aprotinn експресионен плазмид pGrxA BPTI и е проектирано място за разпознаване за FXa между слетия партньор и рекомбинантния aprotinn. След като се експресира под формата на включено тяло, партньорът за сливане се пречиства и повторно нагъва чрез гел филтрация. Партньорът за сливане беше изрязан от FXa, за да се получи протеин със същата активност като естествения продукт. Чрез оптимизиране на условията на експресия, добивът е значително подобрен в сравнение с предишни системи за експресия.

Оптимизиране на експресията на инженерни бактерии:

 

Инокулирайте бактерии с глицеролна епруветка върху LB/AMP агарови плаки, култивирайте при 37 градуса за 20 часа, изстържете колониите и ги инокулирайте в 5 mL течна среда LB/AMP при 37 градуса, 200 r/min и култивирайте за една нощ. Инокулирайте 5% от инокулума в 100 mL среда от царевична суспензия, култивирайте при 37 градуса и 220 r/min на шейкър, индуцирайте за 7 часа и след това центрофугирайте (8000 r/min, 5 min, 4 градуса), за да съберете бактериалните клетки. Претеглете мокрото тегло на бактериалните клетки и открийте тяхната експресия с 15% SDS-PAGE.

Отглеждане във ферментационен резервоар

 

Култивиране във ферментационен резервоар:

Използвайки немски резервоар за ферментация Biostat 30 L, при 37 градуса, с разтворен кислород, контролиран на 20%, pH 7,0. Използвайки ферментационен резервоар за експресиране на слетия протеин, 260 g мокри бактериални клетки бяха получени от 16 L ферментационен бульон, приблизително 16 g/L; Нивото на експресия е около 45%,

Разрушаване на стените и придобиване на бактериални клетки от включващи тела:

 

След като култивирането приключи, съберете бактериалните клетки, добавете 1 g бактериални клетки към 10 mL разтвор А (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), суспендирайте ги старателно, обработете клетките с ултразвук в ледена баня, работете 30 секунди, интервал от 10 секунди, мощност 400 W, 30 цикъла. Прехвърлете течността в центрофужна епруветка, центрофугирайте при 4 градуса и 8000 r/min за 15 минути, а утайката е суровото тяло на включване.

Приготвяне на разтвор за разтваряне на тела на включване:

 

Промийте суровото тяло на включване с разтвор B (50 mmol/L Tris HCl, рН 8,0, 1 mmol/L EDTA, 1% Triton-X100) два пъти, всеки път за 0,5 часа, центрофугирайте за отстраняване на супернатантата и получете относително чисти тела на включване. Добавете 1 g включени тела към 5 mL разтвор C (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L урея, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), инкубирайте една нощ при 4 градуса, денатурирайте и разтворете, центрофугирайте при 12000 r/min за 15 минути и съберете супернатантата, за да получите разтваряне на включващите тела решение. Получаване на рекомбинантен апротин.

Фармакологични ефекти:

 

 

Апротинининхибира човешки трипсин, фибринолитичен ензим, плазмен и тъканен ангиотензин чрез обратими ензимни инхибиторни комплекси, образувани в определено химично съотношение. Протеазите със серинова активност играят основна роля в кининовата система на вазопресин кининоген, системата на комплемента и коагулационната система, където плазминът и плазменият вазопресин играят критична роля.

 

Апротинът упражнява своя инхибиторен ефект чрез образуване на апротин протеазен комплекс чрез сериновата активна част на ензима. Въпреки това, когато се комбинира с различни протеази, той проявява различни константи на дисоциация. Свързването с трипсин е най-силно (Ki=0.06nmoN), което е една от най-ниските константи, докладвани при протеин-протеинови взаимодействия (Laydunski et al. 1974). Свързването с човешкия фибринолитичен ензим не е много силно. Поради високата стойност на K на ензимния инхибиторен комплекс (Ki=1 nmoN), той може да е обратим (Wimann, 1980), а комплексът, който се свързва с човешкия плазмен ангиотензин, е доста слаб (Ki=30 nmol/l), но все още в рамките на терапевтичния диапазон на апротин (Nakahara, 1983).

 

Апротин не само се свързва със свободни ензимни молекули, но и с ензими, които вече са се свързали с трети компонент (ако активният център на ензима все още има способност за свързване). Следователно, апротин инхибира свободните фибринолитични ензими и може също така да инхибира междинния фибринолизин верижно киназен комплекс, образуван по време на тромболитична терапия с верижна киназа (Wimann, 1980).
Антифибринолитичният ефект на апротин се основава на инхибирането на плазмина, активиран от протеинова хидролиза. За разлика от синтетичните антифибринолитични разтворители, поради директното си инхибиране на свръхактивирания плазмин, апротин не само защитава директния субстрат (фибрин) от разграждане от плазмин, но също така защитава фибриногена, факторите V и VIII в плазмата и алфа 2-глобулина в серума.

 

В експериментите с индуциран от ендотоксин шок и хиповолемичен шок Trasylol може значително да инхибира активирането на кининоген. (Massion et a1．1972).
Trasylol може да предотврати или забави развитието на белодробен интерстициален оток (шоков бял дроб). Неговият инхибиторен ефект зависи от-дозата и-от времето (Lorthioir et al., 1973).
По време на шок исхемичният панкреас може да произведе силно токсично пептидно вещество, а именно миокарден инхибиторен фактор (MDF). Този фактор е тясно свързан със смъртта от шок.

 

MDF може да бъде открит в плазмата на мишки, кучета, маймуни и хора с хеморагичен, септичен, кардиогенен шок и шок от изгаряне. MDF може да причини намаляване на контрактилитета на миокарда във всички случаи на кървене и в същото време причинява свиване на висцералните съпротивителни съдове, което води до локална исхемия и производството на повече MDF. Освен това, поради токсичното увреждане, причинено на ретикулоендотелната система, неговото изчистване в кръвния поток се забавя. Trasylol може значително да предотврати производството на MDF (Lefer 1984).

Апротинин, като съединение с малка молекула, което се съпротивлява на фибринолизата, проявява значителни и специфични ензимни инхибиторни свойства. Той не само ефективно инхибира активността на трипсина, но също така действа екстензивно върху други свързани протеолитични ензими, като по този начин играе важна роля в експериментите с клетъчна биология. Особено по време на клетъчен и тъканен лизис и хомогенизиране, Aprotinn може да служи като ефикасен протеазен инхибитор, ефективно предотвратявайки случайно разграждане на целевите протеини, което е от решаващо значение за поддържане на целостта и точността на пробата.

Инхибиторният ефект на Aprotinn показва ясна зависимост от дозата, т.е. с увеличаване на концентрацията му инхибиторният ефект върху фибринолитичната активност също се увеличава съответно. Тази функция позволява на изследователите да контролират по-точно експерименталните условия, за да получат по-надеждни и възпроизводими експериментални резултати. Междувременно Aprotinn може също така да удължи времето за съсирване на кръвта, което допълнително потвърждава важната му роля в механизма на коагулация. In vitro експерименти показват, че Aprotinn е ефективен ендогенен инхибитор на пътя на кръвосъсирването, който може да повлияе и регулира ключови процеси в процеса на кръвосъсирване.

Апротини също демонстрира своите уникални фармакологични ефекти. Той може значително да инхибира процеса на разтваряне на кръвния съсирек in vitro, да удължи времето на кървене при подрязване на опашката при плъхове и да удължи времето на коагулация в човешката плазма. Тези открития предполагат, че Aprotinn може да има потенциални антикървене и антитромботични ефекти. За по-нататъшно валидиране на ефекта in vivo, изследователите проведоха експерименти с модел на артериовенозен къс кръг на плъх. Резултатите показват, че Aprotnin може значително да намали теглото на кръвните съсиреци, като допълнително подкрепя потенциала му като антитромботично лекарство.

В обобщение, апротин, като съединение с малка молекула, което инхибира фибринолизата, демонстрира значителни ензимни инхибиторни свойства и фармакологични ефекти както in vitro, така и in vivo. Приложението му в експерименти с клетъчна биология предоставя на изследователите мощни инструменти, докато откритията му в in vivo проучвания предоставят важни улики и основа за развитието му като лекарство против кървене и антитромботични лекарства. В бъдеще, с по-нататъшни изследвания на механизма на действие на Aprotnin и клинични изпитвания, се очаква да видим неговото по-широко приложение в медицинската област.

Популярни тагове: апротинин cas 9087-70-1, доставчици, производители, фабрика, търговия на едро, купуване, цена, насипно състояние, за продажба