L-тиоглутаминова киселинае натурален продукт, който се преобразува от глюкозинолат-подобни прекурсори в зеленчуци Grannymonda като зеле, зелена горчица и броколи. Има различни здравни ефекти и се използва широко за предотвратяване на хронични заболявания като рак, сърдечно-съдови заболявания и диабет. Той се среща широко в кръстоцветни растения, като зеле, карфиол и зеле. Има много фармакологични действия, като противоракови, противовъзпалителни, антиоксидантни, невропротективни и т.н. Следователно синтетичният метод на L-тиоглутаминовата киселина привлече много внимание.
Понастоящем методите за синтезиране на L-тиоглутаминова киселина могат да бъдат разделени на две категории: биологична ферментация и химичен синтез. Тези два метода са описани подробно по-долу.
Метод на биологична ферментация на L-сулфорафан:
Методът на биологична ферментация е метод за синтезиране на съединения с микроорганизми. Чрез скрининг на бактериални щамове и оптимизиране на условията на култивиране, микроорганизмите могат да произвеждат L-тиоглутаминова киселина по време на процеса на ферментация. Сега е установено, че много щамове могат да синтезират L-тиоглутаминова киселина, като Escherichia coli, Streptococcus thermophilus и така нататък. Сред тях най-разпространен е методът за синтезиране на L-тиоглутаминова киселина от щамове, представени от Escherichia coli. Конкретните стъпки са както следва:
1. Изолирайте L-тиоглутамат-продуциращи щамове, като Escherichia coli, от почва или растителна тъкан;
2. Приемете подходяща среда и условия за култивиране, като температура, pH стойност, време за култивиране и т.н., за култивиране на Escherichia coli;
3. Съберете ферментационния бульон на Escherichia coli, извършете определена обработка и пречистване и получете L-тиоглутаминова киселина.
Метод за химичен синтез на L-сулфорафан:
Методът на химичния синтез е да се използва методът на химическата молекулярна реакция за синтезиране на L-тиоглутаминова киселина чрез различни синтетични пътища. Понастоящем методите за химичен синтез се разделят главно на четири типа: метод на холинова сол, метод на сулфурилхлорид, метод на карбонилна редукция и метод на агарозен сулфат.
1. Метод с холинова сол:
Този метод е един от често използваните синтетични методи. Продължете както следва:
① Първо, L-метионинът и холинът реагират при киселинни условия, за да генерират рядък азотен заместител на L-тиоглутаминовата киселина.
② Нагряване и хидролизиране на азотни заместители в L-тиоглутаминова киселина при алкални условия.
Предимството на този метод е, че реакцията е проста и лесна за овладяване, но добивът е нисък.
2. Метод със сулфонилхлорид:
Този метод използва реакция на електрофилно заместване за синтезиране на L-тиоглутаминова киселина. Продължете както следва:
① Реакция на L-метионин и сулфонил хлорид при алкални условия за получаване на сулфинат на L-тиоглутаминова киселина.
② Сулфинатът се хидролизира при алкални условия за генериране на L-тиоглутаминова киселина.
Предимството на този метод е, че реакцията е лесна за контролиране и добивът е висок, но трябва да се използва токсичен сулфонилхлорид.
3. Метод на карбонилна редукция:
Методът е да се използва реакция на редукция за синтезиране на L-тиоглутаминова киселина. Продължете както следва:
①L-метионин реагира с ацетонимин, за да генерира пиридин пиримидин-2-ен-4-он и пиримидин пиримидин-2-ен-4-он-5-сулфат едновременно
②Пиримидин пиримидин-2-ен-4-он-5-сулфат се редуцира до получаване на L-тиоглутаминова киселина.
4. Метод с агарозен сулфат: Този метод е да реагира L-метионин и агарозен сулфат при киселинни условия за генериране на L-тиоглутаминова киселина. Благодарение на добрата каталитична активност на сулфата, ефективността и селективността на реакцията се подобряват. По-висок, но по-тромав за работа.
В научните изследвания откриването на L-сулфорафан е много важно. Сред тях методът с агарозен сулфат е един от класическите методи за откриване. Методът с агарозен сулфат и неговите стъпки ще бъдат описани подробно по-долу.
Експериментален принцип
Методът на агарозния сулфат се основава на образуването на жълт комплекс от L-тиогалактопикрин и бариев сулфат, сол, образувана при киселинни условия, като се използва агароза като скеле за отделяне на L- Методът на сулфорафан. Методът се основава на факта, че при киселинни условия жълтият комплекс, образуван от реакцията на бариев сулфат и L-сулфорафан, не е лесно разтворим във вода и се утаява в агароза, така че да се отдели и открие L-сулфорафан.
Експериментални стъпки:
Стъпка 1: Пригответе суспензията от агарозно-бариев сулфат
Претеглете подходящо количество агароза и бариев сулфат, добавете определено количество дестилирана вода след смесване и разбъркайте старателно, загрейте до разтваряне или равномерно смесване, филтрирайте суспензията с филтър с размер на порите 0.22um и след това се вари в продължение на 3 до 5 минути. Когато суспензията се охлади до под 50 градуса, но все още не се втвърди, изсипете разтвора в петриево блюдо и го поставете на стайна температура, докато се втвърди.
Step 2: Sample preparation and processing:
Претеглете пробата или стандарта за тестване, добавете достатъчно {{0}}.01 М разтвор на натриев пирофосфат за разтваряне, добавете съответния обем хлороформ за екстрахиране, центрофугирайте за 10-15 минути , отстранява се течността от горния слой, изпарява се хлороформът, за да се събере остатъкът, добавят се 2 mL вода и 2 mL концентрирана солна киселина, екстрахира се отново с хлороформ, центрофугира се и горният слой се взема. Вземете 24 ml от горната течност, добавете 0,2 ml 2% разтвор на меден нитрат и 0,4 ml 5% разтвор на оловен нитрат, екстрахирайте веднъж с хлороформ, центрофугирайте и вземете горната течност, която може да се използва като експериментална проба за тестване.
Стъпка 3: Експеримент за повторен анализ:
Пробите се добавят към суспензията от агарозно-бариев сулфат и се нагряват във водна баня до втвърдяване при 80 градуса за 2 часа. След като пробата се втвърди, суспензията от агароза-бариев сулфат се охлажда до стайна температура и комплексът от агароза-бариев сулфат-проба се разтваря при буферни условия на лимонена киселина и амониева сол. Накрая изплакнете последователно с вода и визуално проверете цвета на комплекса в агарозната сфера.
Стъпка 4: Анализ на резултатите:
Измерете абсорбцията на филтрата след повторен анализ, за да построите стандартна крива, като по този начин получите съдържанието на L-сулфорафан.
Методът с агарозен сулфат е класически метод за отделяне и откриване на L-сулфорафан. Чрез поредица от стъпки L-сулфорафанът може да бъде отделен и съдържанието му да бъде открито. Методът има предимствата на простота, висока чувствителност и точни резултати и обикновено се използва за откриване на L-сулфорафан в храни, козметика и фармацевтични продукти.
Резюме: С развитието на науката и технологиите методът за синтез на L-тиоглутаминова киселина непрекъснато се оптимизира и подобрява. В същото време методът на биологична ферментация и методът на химичен синтез също имат своите предимства и недостатъци и кой метод да се използва зависи от действителната ситуация.