GLP-1(линк:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) е полипептиден хормон, състоящ се от 30 аминокиселини. Със задълбочените изследвания на GLP-1 са разработени все повече синтетични методи. Тази статия ще представи систематично известните в момента методи за синтез на GLP-1.
Метод 1, синтез на твърда фаза:
Твърдофазовият синтез е широко използван метод за синтез на пептиди и протеини и също така често се използва за синтез на GLP-1. При твърдофазния синтез основната структура се образува чрез свързване на първата аминокиселина със смолата. След това следващата аминокиселина се добавя в последователност и химически реагира с подходящ кондензиращ агент. Накрая, целевият продукт може да бъде получен чрез разцепване на полипептида от смолата.
Значението на твърдофазния синтез е, че той дава възможност за автоматизиране и широкомащабно производство на пептиден синтез. Настоящите основни методи за синтез на твърда фаза включват Fmoc и Boc. Сред тях методът Fmoc използва защитната група N-Fmoc за защита на пептида, докато методът Boc използва терт-бутилоксикарбонил за защита на карбоксилната група.
Метод две, синтез в течна фаза:
Синтезът в течна фаза е традиционен метод за синтез на пептиди, при който реагентите се поставят в течната фаза за реакцията. Предимството на синтеза в течна фаза е, че реакционните условия са меки и подходящи за модифициране на чувствителни химични структури. Въпреки това, поради твърде много реагенти, процесът на пречистване е относително тромав. Химичните реакции в синтеза в течна фаза включват:
1. Реакция на кондензация:
Реакцията на кондензация е една от най-основните реакции в пептидния синтез, т.е. карбоксилната група, инициирана от кондензиращи агенти като DCC и HOBt, е свързана с аминогрупата на аминокиселината чрез реакция на ацилиране. Реакционните условия са меки и добивът е висок.
2. Реакции на елиминиране:
Реакцията на елиминиране е да редуцира метионина до дитиол от NaBH4 и други редуциращи агенти, което го прави неактивен. Реакцията трябва да се проведе при основни условия.
3. Премахване на защитни групи:
Поради различните функции на аминокиселините в пептидната верига, различни защитни групи ще бъдат използвани за защита. След завършване на синтеза, защитната група трябва да бъде отстранена. За метода Fmoc обикновено се използва пиперидин за отстраняване на Fmoc; докато за метода Boc, TFA се използва за отстраняване на Boc.
Трети метод, химичен синтез:
GLP-1 е полипептиден хормон с важна биологична активност. Неговият синтез може да се осъществи по различни методи, сред които химическият синтез е един от най-често използваните методи. Предимството на химическия синтез е, че той може да произвежда целеви продукти с висока чистота, които са подходящи за широкомащабно производство. Методът на химическия синтез и подробните стъпки на GLP-1 ще бъдат представени по-долу.
1. Синтетичен маршрут и избор на защитна група:
Молекулата GLP-1 се състои от 36 аминокиселини, включително 21 L-тип и 15 D-тип аминокиселини. Преди извършване на синтеза е необходимо да се избере подходящ синтетичен път и да се избере съответната защитна група според синтетичните условия. Твърдофазовият синтез на Fmoc обикновено се използва за автоматизиран широкомащабен синтез. Този метод използва N-9-флуороимидо карбоксилна защита (N-Fmoc) като защитна група и също така трябва да избере подходяща вторична защитна група (като терт-бутил или метил), за да осигури защитата на специфични места. Всеки път, когато се добавя нова аминокиселина, Fmoc защитната група трябва първо да се отстрани и след това да се добави защитеното свързващо вещество на следващата аминокиселина.
2. Синтез на основната аминокиселинна последователност:
Основната последователност на GLP-1 се състои от 21 аминокиселини, включително ключов серин и четири дипептидни последователности на пролил-глутаминова киселина. При твърдофазния синтез, синтезът на основната последователност може да бъде разделен на следните стъпки:
2.1. Добавете карбамат на оцетна киселина (Fmoc-NH-CH2CO2Et) и 2-Cl-Trt-Cl към синтетична смола в твърда фаза и извършете реакция на кондензация с DIC/NMM свързващ агент.
2.2. Отстранете Fmoc защитната група чрез премахване на защитата на груповата реакция.
2.3. Добавете следващата аминокиселина, повторете стъпка 1 и стъпка 2 последователно, докато се синтезира основната последователност.
2.4. Образуване на пентапептидни структури върху твърдофазова смола. Добавете реагента за ацетализация към твърдофазната смола, реагирайте с агента за разпознаване на N-края (като HBTU), добавете защитната група на страничната верига на серина като спомагателен редуциращ агент и след това отстранете защитната група Fmoc.
2.5. Под катализата на Bacillus subtilis трансфераза (ProTide), пентапептидната структура претърпява обменна реакция с прекурсора на серин йодоацетат.
3. Синтез на останалата аминокиселинна последователност:
След завършване на синтеза на основната последователност е необходимо да продължите да добавяте останалите аминокиселини, включително L- и D-тип аминокиселини. Добавянето на тези аминокиселини трябва да започне от основната последователност, да добави следващата аминокиселина в последователността и да използва съответния кондензиращ агент за извършване на химични реакции, докато се синтезира пълна GLP{2}} полипептидна молекула. По време на този процес е необходимо също така да се избере подходяща защитна група, както се изисква, и да се извършат етапите на реакция, отстраняване на защитна група и добавяне на аминокиселина в последователност.
4. Лечение с натриев хидроксид:
След добавянето на всички аминокиселини върху твърдофазната смола се образува непълно синтезирана пептидна верига, която трябва да бъде обработена, за да се образува напълно оформена пептидна молекула. Първо, неоформеният пептид трябва да се хидролизира от натриев хидроксид, така че С-терминалната карбоксилна група, първоначално прикрепена към смолата, да се отдели от смолата и защитната група да се отдели във вода. След реакцията на хидролиза се получава целевият продукт.
5. Утаяване и измиване:
След обработката хидролизираният разтвор се третира с киселина за утаяване на целевия продукт. След това пелетата се ресуспендира във вода, последвано от интензивно промиване за отстраняване на примесите.
6. Пречистване:
Последната стъпка е пречистване на желания продукт, обикновено с помощта на високоефективна течна хроматография. По време на този процес чистотата на продукта може да се определи чрез откриване на пика на разтвора в масовия спектър. Накратко, химическият синтез на GLP-1 изисква множество кръгове от сложни реакции и стриктни процеси на пречистване, за да се получи накрая активният целеви продукт.
Метод четири, биосинтеза:
GLP-1 е важен полипептиден хормон с различни физиологични ефекти, включително насърчаване на инсулиновата секреция, потискане на апетита, намаляване на телесното тегло и поддържане на инсулиновата чувствителност и др. Методът на биосинтеза на GLP-1 се синтезира главно от L клетки в панкреатичната жлеза и скоростта на неговия синтез се регулира с хранителния прием. Подробните стъпки са представени, както следва:
1. Подготвителна работа преди синтеза:
Преди биосинтезата на GLP-1 трябва да се извърши известна подготвителна работа, включително определяне на използвания клетъчен тип, задаване на условията на култивиране и избор на подходящия каталитичен ензим. L клетките са основният източник на синтеза на GLP-1, защото съдържат прекурсори на два хормона, GIP (глюкагоноподобен пептид 1) и GLP-1. L клетки могат да бъдат изолирани от чревния епител на зайци или мишки. Преди биосинтеза клетките трябва да бъдат култивирани до достатъчен брой и трябва да се осигурят достатъчно хранителни вещества и подходящи условия за култивиране. Освен това е необходимо да се избере подходящият каталитичен ензим за насърчаване на реакцията.
2. Синтез и преработка на прекурсори:
Биосинтезата на GLP-1 се извършва главно в L клетки, а неговият предшественик е съставен от два хормона, GIP и GLP-1. След навлизане в ендокринните клетки GIP и GLP-1 се обработват от протеолитични ензими и се разцепват на отделни пептиди. Серия от ензими и кофактори участват в този процес, включително прекурсорна полипептидна ацидаза (PC2), изомераза и късни адхезионни фактори.
3. Взаимна конверсия между полипептидни сегменти:
След обработка GIP и GLP{0}} пептидите се рекомбинират, за да образуват GLP-1 полипептид. Този процес изисква използването на глюкагоноподобен пептид 1 (GLP-1) като матрица, към която други отделни пептиди се комбинират, за да образуват нови съставни полипептиди. Този процес също така изисква някои специфични ензими и фактори, включително Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) и Carboxypeptidase E (CPE).
4. Секреция на GLP-1:
След като GLP-1 се синтезира и обработи, той се съхранява в цитоплазмата и вътрешните везикули на ендокринните клетки. Когато се стимулират от диета, ендокринните клетки освобождават GLP-1 и влизат в кръвообращението през микросъдове. Този процес се регулира и контролира чрез серия от пътища на сигнална трансдукция, включително cAMP-Ca2 плюси така нататък.
Накратко, биосинтезата на GLP-1 включва съвместното действие на множество връзки и фактори. Комбинацията от биосинтеза и химичен синтез може да осигури по-добра основа и подкрепа за изследванията и производството на GLP-1.
Метод пети, ензимен синтез:
Ензимният синтез е синтез на пептидни вериги чрез катализа на биологични ензими. В сравнение с традиционните методи за синтез в течна фаза, ензимният синтез може да се извърши при стайна температура и може да се избере широка гама от суровини. Обикновено за катализиране на синтеза се използват ензими като тета-течна синтаза, AEP, ACE и др.
В заключение, гореспоменатите методи са приложими методи за синтез на GLP-1. Различните методи са подходящи за различни експериментални условия и среди за фармацевтично производство.