Протеиназа К прахе високоефективна, неспецифична серинова протеаза, широко използвана в молекулярната биология и биохимия, главно за разграждане на протеини и отстраняване на замърсяващи протеини от препарати с нуклеинова киселина. Той се извлича от албума на гъбичките Engyodontium (преди това албум Tritirachium) и поддържа своята активност в широк диапазон от температури (20-60 градуса) и рН (4-12), дори когато се инкубира в разтвор, съдържащ SDS (0,5-1%) или урея (4M) при условия на дениране.
Ензимът ефективно разгражда широк спектър от протеини, включително RNase и DNase, чрез разцепване на пептидни връзки (преференциално хидролизиране на карбоксилния край на алифатни/ароматни аминокиселини) и следователно се използва за отстраняване на нуклеаза при екстракция на ДНК/РНК, за да се осигури целостта на нуклеичната киселина. В допълнение, той обикновено се използва при храносмилането на тъканите (напр. Проби, вградени в парафин), клетъчен лизис и изследвания на протеомиката.
Протеиназата К прах обикновено се доставя в лиофилизирана форма, която е силно стабилна (-20 градус за дългосрочно съхранение) и трябва да се разтваря в буфер (напр. Tris-HCl, EDTA) преди употреба. Активността му зависи от Ca²⁺, но хелативните агенти като EDTA само частично инхибират ензимната активност. Препоръчва се саморазграждане по време на работа и се препоръчва инактивиране на топлина при 65 градуса. Поради мощната си способност за хидролизиране на протеин е необходима внимателна защита, за да се избегне контакт с кожата или лигавицата.
Протеиназа К прах, известен също като протеиназа К или ЕК 3.4.21.14, е серинова протеаза, изолирана и пречистена от албума на Tritirachium Limber. От първата си изолация от Wolfgang Ebeling et al. През 1974 г. протеиназата К се използва широко в биохимията, молекулярната биология, медицината и индустрията поради високата си активност и широката специфичност на субстрата.
Приложения в биохимията и молекулярната биология
В процеса на екстракция на ДНК и РНК основната функция на протеиназата К е да се разграждат протеини, свързани с нуклеинови киселини, което позволява ДНК или РНК да бъдат свободни в разтвор за последващо екстракция и пречистване. Поради своята стабилност и висока активност при денатуриращи агенти като урея и SDS, протеиназата К обикновено се използва за изолиране на плазмиди или геномна ДНК и РНК.
Протеиназата К може да инхибира активността на РНК и да предпази РНК от разграждане.
1. Екстракция на ДНК и РНК
Екстракция на ДНК: Протеазата К може да хидролизира хистони, които се свързват с ДНК, което позволява на ДНК да се дисоциализира в разтвор. Впоследствие примесите се отстраняват чрез различни методи като екстракция на фенол хлороформ, утаяване на етанол и др. И се събира пречистена ДНК.
Екстракция на РНК: По време на процеса на екстракция на РНК, ензимите на РНК обикновено присъстват в околната среда, а самата система за проби може също да съдържа РНК ензими, което прави РНК силно податлива на разграждане. Добавяне на малко количество от
2. In situ технология за хибридизация
В технологията за хибридизация in situ, протеиназата К обикновено се използва за преработка на хибридизация за усвояване на протеини, заобикалящи целевата ДНК, увеличаване на вероятността от свързване на сондата с целевата нуклеинова киселина и засилва сигнала за хибридизация. Трябва обаче да се отбележи, че когато концентрацията на протеиназа К е твърде висока, времето на храносмилането е твърде дълга, или температурата на инкубацията е твърде висока, тя може да причини увреждане на клетъчната структура, което води до проливане на тъканните участъци и изчезването на клетъчните ядра, като по този начин засяга резултатите от хибридизацията. Следователно, в практически приложения е необходимо строго да се контролира времето на концентрация и лечение на протеиназа K.
3. Инактивиране на вируса и дезинфекция
Protease K, поради силната си протеолитична активност, може да се използва за инактивиране на вируси и дезинфекция. Изследванията показват, че лечението на чиста вода и битови отпадни води с определена концентрация на протеиназа К може ефективно да инактивира вирусите. Protease K, като вирус, инактивиращ дезинфектант, може да намали потенциалната вреда, причинена от конвенционалните окислителни химически дезинфектанти към човешкото тяло, и неговото производство и транспортиране са безопасни без необратимо замърсяване на околната среда.
4. Западно блотиране и импулсна електрофореза
Protease K също се използва широко при получаването на хромозомна ДНК за импулсна електрофореза, западно блотиране и други експерименти. В експериментите Western blot протеиназа К може да се използва за отстраняване на неспецифични протеини от пробата, подобрявайки специфичността и чувствителността на блота. В експериментите с импулсна електрофореза, протеиназата К може да разгради примесите на протеина в ДНК проби и да подобри ефективността на електрофорезата.
5. Откриване и идентификация на протеини
Протеиназа К прахможе да се използва и за откриване и идентифициране на определени протеини. For example, in the study of transmissible spongiform encephalopathy (TSE), proteinase K can be used to digest proteins in brain tissue samples, and to identify the presence of prion proteins by detecting the resistance of pathogenic prions to proteinase K. In addition, proteinase K can also be used for experiments such as determining the localization of enzymes on cell membranes and removing cationic proteins bound to Ендотоксини (като лизозим и рибонуклеаза А).
Приложения в медицината и индустрията
Клинична употреба: Protease K има определена лекарствена стойност в медицината. Например, лечение на лошо храносмилане със стомашна протеаза, лечение на бронхит с кисела протеаза, лечение на васкулит с еластаза и др. В допълнение, трипсин, химотрипсин и др. Също обикновено се използват за пречистване на хирургични гнойни рани и лечение на плеврален серозал.
Откриване и диагностика на вируси: Протеазата K също има потенциални приложения при откриване и диагностика на вируси. Чрез усвояването на протеините в вирусната проба и излагането на вирусната нуклеинова киселина, тя осигурява удобство за последващо изследване на нуклеиновата киселина.
2. Индустриален сектор
Кожена индустрия: Protease K се използва в кожената индустрия за премахване на косата и омекотяване на лечението, което може да спести време и да подобри условията на хигиената на труда.
Текстилна индустрия: Протеазата K може да се използва в текстилни индустрии, като копринена дегустиране.
Хранителната промишленост: Протеаза K може да се използва в хранителната промишленост за офериране на месо, изясняване на алкохола и т.н.
Детергент: Ензимът добавен перилен препарат е нов продукт при почистващите препарати. Правнителят на пране, съдържащ алкална протеаза, може да премахне петна от кръв и протеинова мръсотия от дрехите. Но когато го използвате, внимавайте да не докоснете кожата, за да не повредите протеина върху повърхността на кожата и да причините алергични реакции като обрив и екзема.
Молекулното тегло на протеиназата К е приблизително 28900 далтона (28,9 kDa), а също така има и литературни доклади за 29,3 kDa. Неговата аминокиселинна последователност и триизмерна пространствена структура са много сходни с субтилизира на семейството на серинната протеаза, но има и някои уникални характеристики.
Структура на дисулфидната връзка: Протеазите K молекулите съдържат дисулфидни връзки, които увеличават стабилността им и им позволяват да поддържат активността в широк диапазон на рН и високотемпературни условия.
CA ² ⁺ Свързващи сайтове:Протеиназа К прахСъдържа две Ca ² ⁺ свързващи места, които, макар и далеч от активния център, са от решаващо значение за поддържане на каталитичната активност на ензима. Премахването на Ca ² ⁺ ще доведе до загуба на протеаза K с около 80% от неговата активност, а повторното въвеждане на Ca ² ⁺ ⁺ може само частично да възстанови своята активност.
Каталитична триада: Протеазата K има каталитичен триаден ASP-HIS69-SER224, който е ключова структура за неговата хидролитична активност.
Механизъм на действие
Протеазата K може за предпочитане да хидролизира естер и пептидни връзки, съседни на С-края на хидрофобните аминокиселини, съдържащите сяра аминокиселини и ароматни аминокиселини, хидролизиращи протеини в къси пептиди. Механизмът му на действие включва главно следните стъпки:
Ензимно свързване на субстрата: След като протеазата К се смесва със субстрата, субстрата се свързва към активното място на ензима, образувайки ензимен субстрат комплекс.
Каталитична реакция: Под действието на активното място пептидната връзка на субстрата се хидролизира, за да образува продукт, отделен от ензима.
Силният ефект на разграждане на протеазата K го прави ключов реагент в различни биохимични реакции, особено в процесите на екстракция на ДНК и РНК. Протеазата К може ефективно да разгради протеините, свързани с нуклеинови киселини, да освободи нуклеинови киселини и да инхибира активността на нуклеазите, намалявайки разграждането на нуклеиновите киселини по време на екстракцията.
Методи за съхранение и използване
1. Метод за запазване
Протеазата K трябва да се съхранява в хладилник на -20 градуса, за да се избегне многократно замръзване и размразяване. Ако разтворът се утаи, той не може да се използва отново. Когато приготвяте протеиназа К-изсушаван на прах, е необходимо да се добави протежение на замразяване-сушене, за да се поддържа високо ниво на твърдо съдържание. Въпреки това, протеиназата К има тенденция да агрегира и да образува утайки в концентрации от 20 mg/ml или по-висока, което представлява значително предизвикателство за високо съдържание на замразяване на съдържание на твърдо вещество.
2. Инструкции за употреба
Когато използвате протеиназа К, е необходимо да се подготви разтвор на подходяща концентрация съгласно експерименталните изисквания. Обикновено работната концентрация на протеиназа К е 0,05-0,2 mg/ml. В експериментите с екстракция на ДНК и РНК извличането на проба изисква приблизително 0,1 mg протеиназа К. За да се подобри ефективността на екстракцията на нуклеинова киселина, дозата на протеиназа К може да бъде по -подходящо повишена. Когато използвате протеиназа К за in situ хибридизация, Western blot и други експерименти, е необходимо строго да се контролира нейната концентрация и време за обработка, за да се избегне увреждане на клетъчната структура.
Протеиназа К прах, като силно активна и субстрат специфична серинова протеаза, има широк спектър от приложения в биохимията, молекулярната биология, медицината и индустрията. Той може да разгради протеините, които се свързват с нуклеинови киселини и освобождават нуклеинови киселини; Увеличаване на възможността сондите да се свързват с насочване към нуклеинови киселини в in situ хибридизационна технология; Използва се за инактивиране на вируси и дезинфекция; Премахване на протеиновите примеси в експерименти с електрофореза на Western blot и импулс; Има лечебна стойност в областта на медицината; Използва се в индустриални области като обработка на кожа, текстилна промишленост, хранителна промишленост и производство на почистващи препарати. Въпреки това, когато използвате протеиназа К, трябва да се обърне внимание на метода му за съхранение и условията за използване, за да се гарантира неговата стабилност и активност.
Популярни тагове: Proteinase K Powder CAS 39450-01-6, доставчици, производители, фабрика, на едро, купуване, цена, обем, за продажба